生物堿的分離方法的確很多，既有經(jīng)典的分離方法，如溶劑萃取法、蒸餾法、沉淀法、鹽析法、結(jié)晶法、膜滲透升華法等，也有較為現(xiàn)代、先進(jìn)的分離方法，如色譜分離法。

　　1.硅膠柱色譜分離法

　　硅膠柱色譜分離法主要利用二氧化硅作為填料，是較為常用的柱色譜分離方法。硅膠為中性無色顆粒，其性能穩(wěn)定。硅膠層析柱適用范圍廣，既能用于非極性生物堿也能用于極性生物堿，且成本低，操作方便，是常見的生物堿的分離方法。

　　2.氧化鋁柱色譜分離法

　　氧化鋁柱色譜分離法是以氧化鋁作為填料的層析分離法，適合于酸性大、活化溫度較高的生物堿的分離。比如采用氧化鋁層析方法正向分離非酚性粉防己堿與粉防己若林堿，其Rf值適中，展開后放置10min以顯色劑噴濕潤效果為最好、且穩(wěn)定，可得到較好的效果。這種柱色譜分離法也是較為常用的生物堿分離的方法之一。這是由于許多生物堿極性較小，氧化鋁對它們吸附較小，而雜質(zhì)常被吸附。

　　3.離子交換樹脂分離法

　　離子交換樹脂對吸附質(zhì)的作用主要是通過靜電引力和范德華力達(dá)到分離純化化合物的目的。隨著人們對生物堿的認(rèn)識和了解，離子交換樹脂已應(yīng)用于生物堿的分離提取中。離子交換技術(shù)有設(shè)備簡單、操作方便、生產(chǎn)周期短、能源消耗少、成本低、產(chǎn)品純度高、不吸潮、不加輔料就可以成型等特點(diǎn)。而傳統(tǒng)的水煮法和水醇法提取分離得到的制劑總是又黑、又大、又粗，使用極不方便;有機(jī)溶劑萃取方法，溶劑用量大，環(huán)境污染嚴(yán)重。因而離子交換樹脂法在生物堿的提取、分離的研究與生產(chǎn)中應(yīng)用日益廣泛。

　　4.高速逆流色譜分離法

　　高速逆流色譜分離法(high speed coutercurrent chromatography，簡稱HSCCC)是一種新的分離技術(shù)，它對生物堿的分離和制備具有很大的優(yōu)勢，特別是對進(jìn)樣量較大的樣品具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，其應(yīng)用前景越來越引人注目。

      經(jīng)過前期對多糖的提取，去除蛋白質(zhì)、色素、小分子等物質(zhì)得到粗多糖，而這些粗多糖其實(shí)是由很多分子量、結(jié)構(gòu)不同的多糖混合而成。為了得到純的多糖即均一性多糖，仍需進(jìn)一步對這些粗多糖進(jìn)行分離純化。

　　1、分步沉淀法

　　多糖的結(jié)構(gòu)和分子量不同，其極性大小不同，在有機(jī)溶劑（如醇或酮）中的溶解度不同，根據(jù)這一原理，可以依此增加醇濃度，從而將多糖按分子量從大到小的沉淀出來。但是分級沉淀法一般得不到均一性多糖。仍需要借助柱層析法等進(jìn)一步純化，方可得到均一性的多糖。

　　2、柱層析法

　　要獲得均一性的多糖，一般是先經(jīng)過陰離子交換柱進(jìn)行粗步純化，然后再用凝膠柱進(jìn)一步純化。有些多糖也采用大孔樹脂柱進(jìn)行純化。下面對這三種柱層析法進(jìn)行詳細(xì)介紹。

　　3、陰離子交換法

　　一般使用陰離子交換柱對真菌、藻類和高等植物的多糖進(jìn)行初步分離。陰離子交換色譜常用的介質(zhì)有DEAE-纖維素、DEAE-瓊脂糖凝膠、DEAE-葡萄糖凝膠。常用的有DEAE-52和DEAE-Sepharose。例如用DEAE-52柱對大杯香菇等菌類、玉米等植物、桑黃等藻類粗多糖進(jìn)行分離純化。使用DEAE-52填料進(jìn)行多糖的初步分離純化，該柱子一般直徑偏大，其中以2.6cm最多，操作過程中流動相的流速也較快，流速一般在0.7-2ml/min之間，以1ml/min最多，至于柱子的長度，選擇范圍較廣，從25-100cm不等。DEAE-Sepharose柱也常被用在對菌類、植物和藻類粗多糖的初步分離純化中，在選擇層析柱的直徑、流速和長度的方面與DEAE-52相似。DEAE-52或DEAE-Sepharose柱的流動相都是純水和不同濃度的NaCl溶液。

　　4、凝膠色譜法

　　凝膠色譜法根據(jù)被分離組分尺寸大小與凝膠的孔徑關(guān)系實(shí)現(xiàn)分離，類似于分子篩的作用。常用的凝膠有葡聚糖凝膠（SephadexG）、SephadexLH-20、聚丙烯酸凝膠ToyopearlHW等。多糖的進(jìn)一步分離往往會選擇用各種凝膠進(jìn)行分離純化。選擇使用哪一種凝膠對多糖進(jìn)行純化的標(biāo)準(zhǔn)是多糖的分子量，不同種類和型號的凝膠能夠分離多糖類型和分子量范圍不同。凝膠柱的柱子規(guī)格常具有長而細(xì)的特點(diǎn)，直徑以1.6cm偏多。無論什么類型的凝膠柱，流動相多為蒸餾水或者一定濃度的NaCl溶液。

一、黃酮提取

（一）溶劑萃取法：

   黃酮苷和極性較大的苷元：甲醇，乙醇，甲醇-水（1：1），丙酮，乙酸乙酯。

    多糖苷：沸水

    花色苷：0.1%鹽酸進(jìn)行提取。

    苷元：氯仿，乙醚，乙酸乙酯。

   注意：苷類提取防止酶解。

（二）堿提酸沉法

 常用堿水：石灰水，Na₂CO₃，稀NaOH，堿性稀醇。

    酸沉：鹽酸

注意：酸堿濃度不宜過高。

（三）炭粉吸附法：適于苷類的精制。大部分可被7%酚-水洗下。

二、分離方法

分離的基本依據(jù)：

極性差異、酸性強(qiáng)弱、分子大小和特殊結(jié)構(gòu)。

（一）柱色譜法

1、硅膠柱色譜法

適于分離異黃酮，二氫黃酮（醇）和高度甲基化或乙?；狞S酮及黃酮醇類。

    分離苷元時(shí)：氯仿-甲醇混合溶劑洗脫。

    分離苷時(shí)：氯仿-甲醇-水或乙酸乙酯-丙酮-水

2、聚酰胺柱色譜

規(guī)律：

A：苷元相同時(shí)，以含水移動相洗脫，被吸附的強(qiáng)弱順序?yàn)椋?nbsp; 苷元>單糖苷>雙糖苷>雙糖鍵苷。

B：與酚羥基的數(shù)目有關(guān)，數(shù)目越多，吸附力越強(qiáng)。與酚羥基的位置有關(guān)，如果酚羥基所處的位置易形成分子內(nèi)氫鍵，則吸附力減弱。

C：不同類型黃酮類化合物，被吸附的強(qiáng)弱順序?yàn)椋狐S酮醇>黃酮>二氫黃酮>異黃酮。  

D：分子內(nèi)芳香化程度越高，共軛雙鍵越多，則吸附力越強(qiáng)。

查耳酮>二氫黃酮，  黃酮>二氫黃酮

3、葡聚糖凝膠色譜法

   凝膠類型：Ssephadex LH-20和Sephadex G兩種類型的凝膠。分離苷元時(shí)：利用吸附作用，游離酚羥基數(shù)目越多，則吸附力越強(qiáng)，越難洗脫。分離苷時(shí)：主要靠分子篩，洗脫時(shí)按苷分子量由大到小的順序依次被洗脫出柱體。

黃酮類化合物              取代基                 V_e/V_o

芹菜素                  5，7，4‘-三羥基         5.3

木犀草素          5，7，3‘，4’-四羥基          6.3

槲皮素            3，5，7，3'，4'-五羥基           8.3

楊梅素       3，5，7，3‘，4’，5‘-六羥基         9.2

山柰酚-3-鼠李糖基        三糖苷                 3.3

   半乳糖-7-鼠李糖苷

槲皮素-3-蕓香糖苷        雙糖苷                 4.0

槲皮素-3-鼠李糖苷         單糖苷                 4.9

常用的洗脫劑：堿性水溶液，含鹽水溶液、醇及含水醇

（二）PH梯度法：用不同濃度的堿分離

（三）硼酸絡(luò)合法     具有鄰二酚羥基的黃酮類化合物可與硼酸絡(luò)合生成易溶于 水的化合物